Pembuatan Media dan Inokulasi

I.              DASAR TEORI       

3.1. Media

Media disini digunakan guna untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba yang diperlukan oleh suatu substrat. Sebelum media tersebut digunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami seperti tauge, daging, telur, wortel, dan sebagainya ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia, organik maupun anorganik) yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, dinamakan media. Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam midia diperlukan persyaratan tertentu yaitu :

1.      Bahan di dalam media harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba.

2.      Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH sesuai dengan kebutuhan mikroba.

3.      Media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang dimaksud tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

3.2. Bentuk, Susunan dan Sifat Media

3.2.1 Bentuk

Bentuk, susunan dan sifat media ditentukan oleh pemadat seperti agar-agar, gelatin dan sebagainya, maka bentuk media dikenal tiga jenis :

a.       Media padat

Kalau ke dalam media ditambahkan 12-15 gr tepung agar-agar per 1000 ml media. Jumlah tepung agar-agar yang ditambahkan tergantung kepada jenis atau kelompok mikroba yang ditanamkan. Ada yang memerlukan kadar air tinggi, sehingga jumlah tepung agar-agar harus rendah, tetapi ada pula yang memerlukan kandungan air rendah sehingga penambahan tepung agar-agar agak banyak. Media pada umumnya dipergunakan untuk ragi, bakteri, jamur, dan kadang-kadang juga mikroalga.

b.      Media cair

Kalau ke dalam media tidak ditambahkan zat pemadat, biasanya media cair digunakan untuk membiakkan mikroalga tetapi juga mikroba lain terutama bakteri dan ragi.

c.       Media semi padat dan semi cair

Kalau penambahan zat pemadat hanya 50% atau kurang dari seharusnya. Ini umumnya diperlukan untuk mikroba yang banyak memerlukan kandungan air dan hidup anerobik atau fakultatif.

3.2.2. Susunan

Sesuai dengan fungsiologis dari masing-masing unsur hara yang terdapat dalam media, maka susunan media pada semua jenis-jenis mempunyai kesamaan isi yaitu kandungan air, kandungan nitrogen, kandungan sumber energi/unsur C, dan kandungan vitamin. Berdasarkan pada persyaratan tersebut susunan media dapat berbentuk :

a.       Media alami

Media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, tepung, daging dan sebagainya. Contoh yang paling banyak adalah telur untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan virus.

b.      Media semisintesis

Media semisintesis adalah media yang tersusun oleh campuran bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis misalnya: kaldu nutrisi, toge agar, dan wortel agar.

c.       Media sintetik

Media yang disusun oleh senyawa kimia seperti media untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan bakteri Clostridium.

3.2.3 Sifat

Penggunaan mikroba bukan hanya pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, tetapi juga untuk tujuan lain, yaitu untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Berdasaarkan pada sifat-sifatnya, dibedakan menjadi :

a.       Medium umum

Media ini digunakan untuk perkembangbiakan dan pertumbuhan satu atau lebih mikroba secara umum. Seperti kaldu nutrisi untuk bakteri. Contoh : agar nutrisi untuk bakteri, agar tauge atau agar kentang dekstrose untuk jamur.

b.      Media pengaya

Media ini dipergunakan dengan maksud memberi kesempatan kepada suatu jenis mikroba untuk tumbuh dn berkembang lebih cepat dari jenis lainnya yang sama berada dalam satu bahan, misalnya kaldu lelenit.

c.       Media selektif

Media yang hanya ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu tetapi mematikan untuk jenis-jenis lainnya. Contoh : agar endo, agar SS, dan lain-lain.

d.      Media differensial

Medium yang dapat ditumbuhi semacam mikroorganisme dengan memberikan ciri tertentu. Mikroorganisme tersebut mampu menguraikan salah satu bahan pembuat medium dimana mikroorganisme yang lain yang sama –sama tumbuh di situ tidak mampu. Contoh : agar darah, agar ecsin metilen biru, dan lain-lain

e.       Media penguji

Media untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba, misalnya penguji vitamin.

f.       Media perhitungan

Media perhitungan maksudnya disini adalah media untuk menghitung jumlah mikroba pada suatu bahan media ini dapat berbentuk media umum, selektif, dan differensial serta penguji.

3.3.Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu cara untuk membebaskan sesuatu seperti misalnya alat-alat, bahan makanan, bahan/zat kimia dan lain-lain dari mikroorganisme, baik yang patogen maupun yang tidak patogen. Beberapa cara untuk mensterilkan medium :

1)      Sterilisasi dengan pemanasan.

a.  Udara panas kering/basah.

Dipakai untuk mensterilkan bahan atau alat yang tahan panas. Alat tersebut dipanaskan  sampai suhu 170 ^oC selama 1 jam.

b. Tyndalisasi

Dipakai untuk mensterilkan  bahan atau alat yang ridak tahan suhu tinggi. Bahan atau alat ini dipanaskan sampai suhu mencapai 100 ^oC selama 30 menit, hal ini diulangi selama 3 hari berturut-turut. Sementara tidak dipanaskan, maka disimpan pada suhu kamar.

c.  Pasteurisasi

Dipakai untuk mensterilkan bahan makanan yang mengalami penguraian apabila dipanaskan pada suhu tinggi. Alat atau bahan dipanaskan  pada suhu 60 – 80 ^oC selama 1 jam dalam waktu 3 hari berturut-turut.

d. Api langsung/nyala Bunsen

Dipakai untuk menstrerilkan inokulasi, mulut tabung atau permukaan meja.

e.  Uap air panas dan tekanan

Dipakai untuk mensterilkan alat atau bahan yang tahan pemanasan tinggi disertai tekanan. Caranya dengan memnggunakan alat yang disebut autoklaf, dimana suhu yang dicapai adalah 121 ^oC dan tekanan 15 lbs.

2)      Sterilisasi dengan radiasi.

Yaitu sterilisasi dengan menggunakan cahaya ultraviolet atau radiasi sinar Co 60 atau Cs 139.

3)      Sterilisasi dengan zat kimia.

Yaitu sterilisasi yang dilakukan dengan menggunakan zat-zat kimia, seperti alkohol 70 %, pormalin 4 %, karbol, lisol, sabun dan bahan sterilisasi lainnya.

4)      Sterilisasi dengan saringan atau filter.

Yaitu sterilisasi yang dilakukan dengan penyaringan. Ada beberapa bahan yang tidak boleh dipanaskan  seperti serum, darah yang sterilisasinya dilakukan dengan penyaringan. Macam-macam penyaringan atau filter antara lain; seitz filter dimana penyaringannya berupa membrane yang terbuat dari kaca yang berlubang lubang dengan diamter 0,45 meter, di mana membran tersebut dapat menahan bakteri. Selain gelas, penyaring dapat terbuat dari asbestos, selulosa ataupun plastik.

5)      Sterilisasi dengan Autoklaf

Yaitu alat serupa tanki minyak yang diisi uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam autoklaf selama 15-20 menit, tergantung banyaknya medium. Medium yang disterilkan sebaiknya diletakkan didalam botol agak kecil, setelah pintu autoklaf ditutup rapat baru kran pintu uap dibuka dan temperatur akan naik sampai 121^oC. Setelah cukup waktu, kran uap ditutup, bila telah mencapai suhu nol autoklaf dibuka secara perlahan, dan setelah dingin dikeluarkan melalui autoklaf dan setelah stabil disimpan di lemari es.

3.4.Penyimpanan Medium

Sebelum dipergunakan medium yang sudah disterilkan, baik medium cair maupun medium padat bisa disimpan di dalam tabung-tabung gelas berupa Erlenmeyer, tabung reaksi ataupun dalam botol. Penyimpanan dalam jumlah kecil biasanya dalam tabung reaksi sebanyak 10-15 ml.

3.5.Pembuatan Medium

Medium semi alami dan medium buatan dibuat dengan mencampurkan beberapa bahan-bahan. Pencampuran ada yang harus dipanaskan dan ada yang bisa larut dalam keadaan dingin. Sterilisasi dilakukan dengan memperhatikan sifat-sifat dari bahan pembuat medium. Bahan alami yang dicampurkan seperti toge, kentang, daging, tanah, dan lain-lain biasnya  dalam keadaan dalam bentuk ekstraknya. Dalam mencampurkan zat-zat kimia harus dihindarkan terbentuknya endapan atau emulsi yang akan mengganggu pengamatan.

Teknik biakan murni tidak saja perlunya mengetahui bagaimana agar mendapatkan suatu biakan yang murni saja, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Inokulasi dimaksudkan untuk menumbuhkan, meremajakan mikroba dan mendapatkan populasi mikroba yang murni. Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan.

      Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur atau biakan murni. ada beberapa cara umum yang dapat dilakukan dengan cara goresan (steak plate), cara taburan atau tuang (pour plate), serta micromanipulator (the micromanipulator methods). Secara alami, bakteri di alam ditemukan dalam populasi campuran. Hanya dalam keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadan tertentu saja populasiini ditemukan dalam keadaan murni . Untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi, dan sifat faalinya, maka organisme yang akan diteliti harus dapat dipisahkan. Berarti harus ada biakan murni yang mengandung satu jenis bakteri saja.

Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan menggunakan bahan cair atau padat. Pada mulanya digunakan gelatin sebagai bahan pemadat. Teknik untuk memperoleh biakan murni ada 3 cara, yaitu: teknik penggoresan agar, teknik agar tuang, dan teknik agar sebar. 

Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulang kali. Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel.

Selain dalam media cair, mikroorganisme juga memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme

3.6.Inokulasi

Pada umumnya bakteri hanya mengenal satu macam pembiakan saja yaitu dengan cara aseksual atau vegetatif, yang pelaksanaan pembiakannya dengan pembelahan diri atau divisio. Sedangkan pada jamur pembiakan dapat secara aseksual maupun seksual atau vegetatif dan generatif. Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati agar tidak terjadi kontaminasi.

Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur murni saja.

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Bakteri yang ditanamkan atau ditaburkan disebut inokulum. Transfer kultur liquid biasanya dikerjakan pada aliran laminar untuk mengurangi bahaya kontaminasi digunakan panas api pada waktu inokulasi.

Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi. Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :

a.       Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam labotarium, pembuataan serum, vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.

b.      Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni.

c.       Pemindahan dengan kawat inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikel yang ujungnya lurus berupa kolongan yang diameternya 1-3mm. Dalam melakukan penanaman bakteri, kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin, kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala.

3.7.Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme yaitu :

1)      Metode Gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, Namun metode Gores ini memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang harus diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni.

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. Berikut akan diperlihatkan beberapa teknik yang digunakan dalam metode gores antara lain yaitu goresan T, goresan radian, goresan kuadran dan goresan sinambung. Gambarnya adalah sebagai berikut:

Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yaitu :

a.       Goresan T                                          c.   Goresan Kuadran

b.      Goresan Radian                                  d.  Goresan Sinambung

Gambar 3.1 Contoh Teknik Metode Goresan

(sumber :http//www.google.com/gambar-metode-goresan)

2)      Metode tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.

...……………

.......................

………………

Gambar 3.2 Contoh Teknik Metode Tebar

(sumber: http//www.google.com/gambar-metode-sebar)

3)      Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

4)      Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan cara meneteskan atau menusukkan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media.

Adapun perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri sebagai berikut :

a)        Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam suatu media.

b)        Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak (Rohimat, 2002).

3.8.Teknik Isolasi dan Pemurnian

Teknik isolasi mikroba untuk memisahkan dan mengidentifikasi, jenis mikroba dari biakan dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat pertumbuhan yang nampak pada media.

1.      Metode penanaman pada agar

Pada metode penanaman pada agar ini, jika sedikit saja sel diletakkan dalam medium agar, maka tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Jika suspensi sel cukup diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik, sehingga masing-masing memiliki kemungkinan tinggi untuk diturunkan menjadi sel tunggal. Namun untuk membuat yang demikian, penting untuk mengambil satu tipe koloni yang diinginkan, memasukkan ke dalam air dan kemudian menanamnya kembali ke agar. Dengan mengulangi prosedur ini beberapa kali, tidak dapat dipungkiri bahwa menjamin untuk memperoleh biakan murni.

2.      Metode Pengenceran       

Metode yang sedikit dapat dipercaya adalah pengenceran. Suspensi diencerkan seri dan contoh masing-masing pengenceran ditanam pada agar. Jika hanya sedikit contoh dari pengenceran tertentu menunjukkan pertumbuhan, diperkirakan bahwa beberapa dari biakan tadi dimulai dari sel tunggal. Metode ini tidak digunakan kecuali jika penanaman pada agar tidak dimungkinkan karena beberapa alasan. Gambaran yang tidak diinginkan dari metode ini adalah bahwa metode ini hanya dapat digunakan untuk isolasi tipe organisme yang dominan dalam populasi campuran. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:

a)      Isolasi Pada Agar Cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah diinkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang. Bila metode gores kuadran dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari  satu sel.

b)       Isolasi Pada Medium Cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3.    Isolasi Sel Tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis

3.9.Haemacytometer

Haemacytometer adalah alat khusus yang digunakan untuk menghitung mikroorganisme. Pada alat ini terdapat kotak-kotak kecil dengan luas 1 / 400 mm² dan kedalaman 0,1 mm. Penggunaannya hampir sama dengan mikroskop adalah dengan meletakkan kaca preparat yang berada di atasnya dan ditutup dengan deck glass. Pengamatan ini dilakukan dengan menggunakan mikroskop agar dapat mengamati sel-sel mikroba baik yang kecil maupun yang besar, yang dibatasi oleh kotak-kotak haemacytometer.

Perhitungan dengan haemacytometer ini merupakan perhitungan langsung karena sample langsung diambil dan diteteskan pada alat haemacytometer dan diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dengan metode ini mempunyai beberapa keuntungan, yaitu semua sel mikroba baik yang masih hidup maupun yang sudah mati dapat dihitung. Sedangkan kelemahannya yakni apabila pengenceran tidak homogen lagi, maka akan terjadi kesalahan dalam perhitungan.

Pengenceran yang dilakukan bertujuan untuk memudahkan pengamatan karena sample kental dapat menjarangkan sel mikrooranisme yang mengakibatkan pengamatan menjadi sulit dilakukan.

3.10.Perhitungan Jumlah Sel

a.       Hitungan Cawan (Pengenceran)

Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung berisi aquadest steril sebanyak 9 ml. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1 ml sampel yang akan diperiksa secara bertahap, yaitu :

1)      1 ml sampel ke dalam tabung pertama, sehingga konsentrasi larutan di dalam tabung pertama menjadi 10^-1.

2)      1 ml dari tabung pertama ke tabung kedua, sehingga konsentrasi tabung kedua menjadi 10^-2.

3)      Dan seterusnya sampai mencapai larutan dengan konsentrasi terendah.

Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 ml larutan dan ditanamkan ke dalam cawan petri berisi media padat. Pertumbuhan koloni yang kemudian timbul pada tiap-tiap cawan dihitung. Cara perhitungan ini harus memperhitungkan faktor kerapatan pertumbuhan koloni, karena jika pertumbuhan koloni terlalu rapat biasanya sulit untuk dipertanggungjawabkan hasilnya. Juga untuk pertumbuhan yang terlalu jarang sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemurniannya untuk dihitung.

b.      Hitungan Mikroskopis Langsung

Pada metode mikroskopis langsung, sampel diletakkan di ruang hitung (seperti hemasiotomeyer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan sebuah mikroskop.

Pada metode ini, hasil pengenceran tidak ditanamkan pada media, tetapi diteteskan ke dalam ruang hitung. Selanjutnya diperiksa di bawah mikroskop terhadap mikroba yang terdapat pada kolom perhitungan. Misalnya didapatkan jumlah yang terhitung 12 sel, maka perhitungan jumlah sel adalah:

Jumlah Sel       =          a x b x c x f

=          12 x 25 x 50 x 10³

=           1,5 x 10⁷ sel/ ml

dimana:

a   =          Jumlah sel yang terhitung.

b   =          Jumlah kotak pada ruang perhitungan.

c   =          Volume tiap-tiap kotak.

f    =          Pengenceran sampel.

Keuntungan metode mikroskopis langsung ini adalah pelaksanaannya yang cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya adalah tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada dalam populasi. Sel mati akan menyerap warna biru, sedangkan sel hidup mereduksi zat warna tersebut secara enzimatif menjadi tidak berwarna, jadi sel-sel akan tampak biru.

Kelemahan lain dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran kecil seperti bakteri, karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan. Hal ini biasanya dapat diatasi dengan mewarnai sel sehingga sel dapat mudah dilihat. Kelemahan-kelemahan lainnya adalah kadang-kadang sel cenderung bergumpal, sehingga sukar untuk membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya adalah dengan menceraiberaikan gumpalan sel tersebut dan kemudian menambahkan suatu bahan anti gumpal, seperti dinatrium etilamina tetra asetat dan tween sebanyak 0,1 %.     

c.       Penggunaan Nefelometer / Turbidometer

Cara ini merupakan perhitungan kerapatan materi (sel) di dalam larutan, yang diberi cahaya. Kualitas bias cahaya yang dilakukan identik dengan kerapatan materi sel yang berada dalam larutan.